酶联免疫吸附试验

1. 底物:各种酶都有对底物的特异性,所以使用不同种类的酶要求有不同的底物.一旦 酶结合物已经确定(如 AP 或 HRP) ,那么可供选择底物的范围是很有限的.在这有限底物的范围 内如何选择合适的底物呢?应按下列几个条件进行选择. (1)底物在未被酶催化以前应该是无色的,而经酶催化后有明显的颜色变化,这样可使结果分辨清楚; (2)所显色泽易干洗脱; (3)显色后的产物要求稳定,在作定量测定时所产生的有色物质应该是可溶性的; (4)价廉,易得而且无毒. 因此,对 AP酶结合物来讲,一般均用硝基苯磷酸盐,显色后呈桔黄色,色泽稳定,用 2 mol/L NaOH 终止反应,可用波长 403nm 测定 O.D 值. 2. 洗涤剂与稀释剂:为了使特异性结合的抗体量尽可能多,包被微量反应板凹孔的抗原 应该稍微过量.但在孵育或洗涤过程中,已吸附的抗原可能有部份会从固相载体上被洗涤下来. 从而使加入被检血清中的特异性抗体以外的蛋白质很可能会吸附到原来包被抗原凹孔的空白处, 增加本底颜色,产生假阳性反应,这是限制 ELISA 特异性的一个因素.因此不少学者在稀释剂及洗 涤剂中加入各种保护性阻剂来抑制非特异性蛋白的竞争性吸附作用.