流式细胞DNA分析

流式细胞仪并非是完全自动化的仪器,准确的实验结果还需要准确的人工技术配合,所以标本制备需要规范,仪器本身亦需要质量控制. (一) 流式细胞术免疫学检测的影响因素和质量控制 流式细胞术在免疫学中有着广泛的应用,其免疫荧光染色的标本制备非常重要,常常由于标本制备过程中出现人为非特异性荧光干扰(尤其在间接免疫荧光染色中)或细胞浓度低等影响检测结果.解决这些影响因素的方法如下: (1) 确保标本上机检测前的浓度为1X106细胞/ml,细胞浓度过低直接影响检测结果. (2) 使用蛋白封闭剂,封闭非特异结合位点,尤其在间接免疫荧光标记时必不可少.常用的蛋白封闭剂为0.5%牛血清白蛋白和1%胎牛血清. (3) 荧光抗体染色后充分洗涤,注意混匀和离心速度,减少重叠细胞和细胞碎片. (4) 设置对照样品,采用与抗体来源同型匹配的无关对照和荧光抗体的本底对照. (5) 判定结果时,应注意减去本底荧光,为使免疫荧光的定量分析更精确,应用计算机程序软件,用拟合曲线方法从实验组的曲线峰值中减去对照组的曲线峰值,可以得到更准确的免疫荧光定量结果. (6) 注意染色后避光,保证细胞免疫荧光的稳定. (二) DNA 倍体分析的质量控制仍没有统一的标准,各文献报道的实验结果差异较大,1993年10月美国癌症研究组织制定了FCMDNA 测定的统一标准,我们根据这些标准并结合国内有经验的专家多年的实践,对FCM的DNA分析技术的质控和注意事项进行说明. (1) 手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时,要避免出血坏死组织. (2) 标本采集后要及时固定或深低温保存,以免组织发生自溶,DNA 降解,而造成测试结果的误差. (3) 固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓度,70%的乙醇固定效果较好. (4) 单细胞悬液制备过程中,注意将待测细胞成分分离出来,减少其他成分的干扰,并注意不要损伤该群细胞. (5) 细胞样品的采集要保证足够的细胞浓度,即1X106细胞/ml,杂质、碎片、团块和重叠细胞应<2%,对肿瘤细胞DNA异倍体的分析样品,至少有20%的肿瘤细胞存在. (6) 石蜡包埋组织单细胞制备时要注意:取材时应选取无自溶、坏死的组织,对肿瘤组织标本,选取含肿瘤细胞丰富的区域;石蜡组织片的厚度要适宜,最好为40～50μm .过薄或过厚的切片均会影响检测结果;彻底脱蜡,以免残留的石蜡