厌氧菌的分离与鉴定

体内菌群的种类和比例正常,人体处于动态平衡健康状态.

分离 (1)编号 取五支无菌水试管,分别用记号笔标明10-1、10-2……10-5. (2)稀释 在无氧无菌的超净厌氧手套箱中的条件下,用无菌注射器吸取1mL混合均匀的液体样品,加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中,用震荡器将其混合均匀,制成10-1稀释液.用无菌注射器吸取1mL10-1稀释液至另一装有9mL生理盐水的厌氧试管中,制成10-2稀释液.依此进行10倍系列稀释,至 10-6,制成不同样品稀释液.通常选10-4、10-5、10-6三个稀释度进行滚管计数. (3)滚管分离 1)滚管 将无氧无菌的琼脂培养基在沸水浴中溶化,置46-50℃恒温的水浴中,待用,当培养基从瓶中取出时,要用N2在培养基内中充气.再在试管中用 N2充气,赶走所有管内空气,然后把培养基加入管内,立即塞上瓶塞.待瓶塞塞入管内,及时拔出充气针头.用无菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三个稀释度各0 .1mL,分别注入待用的试管中,然后将其平放于盛有冰水的瓷盘中迅速滚动,带菌的溶化琼脂在试管内壁会即刻形成凝固层. 2)分离纯化 生成的菌落需挑取出来,镜检其形态及纯度.如尚未获得纯培养物,需再次稀释滚管,并再次挑取菌落,直至获得纯培养物为止.待挑取的单菌落预先在放大镜下观察确定,做好标记.然后将培养基试管固定于适当的支架上,打开试管胶塞,同时迅速将气流适当、火焰灭过菌的氮气长针头插入管内.同时,另一液体厌氧管去掉胶塞插入另一灭过菌的通气针头.将准备好的弯头毛细管小心插入固体培养基内,找准待挑菌落,轻轻吸取,转移至液体试管内,加塞.37℃培养,培养24h或更长时间或待培养液混浊后检查已分离培养物的纯度. 3)划线分离 将试管橡皮塞的一端在火焰上灼烧一下,挨着打气针塞住管口,在针头快速取下前,通气15-20s,管口一端在火焰上烧片刻.旋紧管塞,划线后的卷管直立保温,使用CO2:H2=80:20,因为CO2比空气重,开启后管塞不致有空气残留.划线后的滚管,置34-37度下培养,便可长出菌落. 菌种的鉴定 1糖发酵试验 糖发酵实验是最常用的生化反应,在肠道细菌鉴定上尤为重要.绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖的能力上有很大差异,有些细菌能分解糖并产酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和气体(如氢、甲烷、二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气.例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气;伤寒杆菌能