血清蛋白电泳

醋酸纤维素膜电泳法白蛋白0.61～0.71(61%～71%)、α1球蛋白0.03～0.04(3%～4%),α2球蛋白0.06～0.10(6%～10%),β球蛋白0.07～0.11(7%～11%),γ球蛋白0.09～0.18(9%～18%).

1)将缓冲液加入电泳槽内,调节两侧槽内的缓冲液,使其处于同一平面. (2)醋酸纤维素薄膜的准备:取醋酸纤维素薄膜(2cm×8cm)在毛面的一端(负极侧)1.5cm处用铅笔轻划一横线,做点样标记.编号,并标明正、负极后,将薄膜置于巴比妥-巴比妥钠缓冲液中浸泡,待充分浸透后(一般为20min)取出,夹于洁净滤纸中间吸去多余的缓冲液. (3)将醋酸纤维素薄膜毛面向上贴于电泳槽支架上拉直.用微量吸管吸取无溶血血清3～5μl于横线处沿横线加样,样品应与薄膜的边缘保持一定的距离,以免电泳图谱中的蛋白区带变形,待血清渗入薄膜后,反转薄膜,使光面朝上,平直地贴于电泳槽支架上,用双层滤纸或四层纱布将薄膜的两端与缓冲液连通,稍待片刻. (4)接通电源,注意醋酸纤维素薄膜上的正、负极,切勿接错.电压90～150v,电流0.4～0.6mA/cm(不同的电泳仪所需电压,电流可能不同,应灵活掌握),夏季通电45min,冬季通电时间稍长,约为60min,电泳区带展开约25～35mm即可. (5)染色:通电完毕,取下薄膜直接浸于丽春红S染液或氨基黑10B染色液中,染色5～10min(以白蛋白区带染透为止),然后在漂洗液中漂去剩余染料,直至背景无色为止. (6)定量: ①比色法:将漂洗的薄膜吸干,剪下各染色的蛋白区带入相应的试管中,在白蛋白管中加0.4mol/L氢氧化钠6ml(计算时吸光度乘以2),其余各管加3ml,振摇数次,置37℃水箱20min使其色泽浸出.氨基黑10B染色用分光光度计在620nm处读取各管吸光度,然后计算出各管的含量(同时做空白管对照). 丽春红S染色时浸出液用0.1mol/L氢氧化钠,加入量同上法.10min后,白蛋白管内加400ml/L醋酸0.6ml(计算吸光度时乘以2),其余各管加0.3ml,以中和部分氢氧化钠,使色泽加深,必要时离心,取上清液用分光光度计在520nm处读取各管的吸光度(同时作空白对照),然后计算各自的含量. ②光密度计扫描法:A.透明:吸去薄膜上的漂洗液(为防止透明液被稀释影响透明结果),将薄膜浸入透明液中2～3min,然后取出,以滚动的方式平贴于洁净无划痕的载物玻璃片上(切勿产生气泡),将此玻片竖立片刻,除去多余透明液后,置于恒温90℃至100℃的烘箱内,烘烤10～15min,取出冷却至室温,用此法透明的各蛋白区带鲜明,薄膜平整,可供直接扫描和永久保存