支气管肺泡灌洗术（BAL）

正常

(1)BALF细胞总数和分类计数检测 ①将上述回收灌洗液装入塑料离心管内以1200r/min,在4℃下离心10min,上清(原液或10倍浓缩)-70℃储存,用做可溶性成分的检测. ②经离心沉淀的细胞成分用Hank液(不含Ca2、Mg2)在同样条件离心冲洗2次,每次5min.弃去上清后加Hank液3～5ml制成细胞悬液.也可以用灌洗液原液减少细胞丢失. ③然后在改良的Neubauer计数台上计数BALF中细胞总数,一般以1×106/ml表示.如果细胞数过高时,再用Hank液稀释,调整细胞数为5×106/ml,并同时将试管浸入碎冰块中备用. ④细胞分类计数,采用细胞离心涂片装置,加入备用细胞悬液(细胞浓度为5×106个/ml)100μl,在4℃下以1200r/min离心10min,通过离心作用将一定数量的BALF细胞直接平铺于盐载玻片上.取下载玻片立即用冷风吹干,置于无水乙醇中固定30min后进行染色,一般用Wright或HE染色. ⑤在40倍光学显微镜下计数200个细胞,进行细胞分类计数. (2)BALF中T淋巴细胞亚群的检测 ①采用间接免疫荧光法,将上述获得的BALF细胞成分,用10%小牛血清RPMI 1640培养液3～5ml制成细胞悬液. ②将细胞悬液倒入平皿中,置于5% CO2 37℃培养箱中孵育2h,进行贴壁处理,去除肺泡巨噬细胞. ③取出细胞悬液,再用Hank液冲洗离心1次,弃上清留20～100μl.经贴壁处理后的细胞悬液中,肺泡巨噬细胞显著减少,淋巴细胞相对增多. ④将经贴壁处理的细胞悬液分装3个小锥形离心管内,每管20～30μl,用微量加样器向标本中加单克隆抗体CD3、CD4和CD8各20～40μl,混匀置于4℃冰箱中作用1～2h. ⑤取出标本,先用Hank液冲洗离心2次,以12000r/min离心20s,然后加羊抗鼠荧光抗体各20～40μl,置于冰箱作用30min. ⑥取现标本用Hank液以同样速度和时间离心冲洗2次,弃上清留20μl充分混匀细胞,取1滴于载玻片上加盖玻片.荧光显微镜下数200个淋巴细胞并计算出标有荧光的细胞阳性率.