真菌性角膜炎检查

诊断比较困难,必须与细菌性角膜溃疡进行鉴别,有农业性眼外伤史,典型的临床表现,是诊断的主要依据,再者,疑为真菌感染时,应作角膜病变处刮片,将取下的坏死组织放于玻片上,滴5%氢氧化钾一滴,覆盖破片,立即镜检,寻找真菌菌丝,有条件时应进行真菌培养.

1.刮片检查

(1)取材:表面麻醉(最好应用0.5%丙氧苯卡因,因该药较其他表面麻醉剂的抑菌作用轻)后,用圆刃刀片从病灶深部或边缘刮取组织.

(2)染色法:常用的方法有革兰染色法,Giemsa染色法及KOH湿片法,有时也可采用特殊真菌染色法(Gomori mefhenamine),其染色的阳性率分别为55%,66%,33%及85%,革兰染色最为简单,真菌呈革兰阳性(深紫色),其他组织为阴性(红色),KOH湿片法是利用KOH溶解刮片中的非真菌杂质而显示菌丝,有报道同时加入亮绿,甲绿或墨水染色(10%氢氧化钾和墨汁以9∶1的比率混合而成的混合液)能增加对比度,光镜下可见真菌细胞壁有墨水或绿色小颗粒附着,而胶原纤维及炎性细胞则未着染,对比强烈,容易识别,缺点为易出现假阳性或假阴性,最近有人采用caleofluor-white染色(CFW染色),此染色剂能与真菌细胞壁的壳多糖和纤维素紧密结合,在荧光显微镜下真菌显示强烈的深绿色.

2.真菌培养

刮片检查简单而迅速,但只能确定是真菌,而不能鉴别真菌菌种及进行药敏试验,因此,还必须进行真菌培养,常用的培养方法及培养温度如下.

(1)血琼脂(blood agar),25℃及37℃下培养.

(2)sabouraud葡萄糖琼脂,25℃及37℃下培养.

(3)马铃薯葡萄糖琼脂,25℃及37℃下培养.

多数酵母菌易在血琼脂中生长,丝状菌易在sabouraud琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂生长(注意镰刀菌在37℃时,2～3天即可生长,而其他真菌在37℃时,则需要1周以上时间才能生长).

3.聚合酶链反应技术(polymerase chain reaction,PCR)

国外已有将临床分离出的真菌进行体外培养,并应用PCR技术进行分型诊断,认为PCR技术对于角膜真菌的快速诊断有良好的应用前景,但需要解决假阳性结果的问题.

4.应用几丁质鉴别真菌

Lamps(1995)指出几丁质是在真菌和节肢动物中含有的多糖结构,而在哺乳动物中缺乏,真菌细胞壁的几丁质成分随着菌种的不同而不同,因此具有很高的特异性,不同荧光标记的凝集素可以与不同几丁质特异性结合,发出特异荧光,以快速诊断并鉴别菌种,国外目前认为此技术为快速特异的真菌诊断手段,国内尚未见报道.

5.角膜活检

当刮片和培养均为阴性结果,临床仍然怀疑真菌感染时除应反复多次进行检查外,还应做角膜活检,用尖刀片切取病灶组织,或用穿透性角膜移植术钻取的病灶组织,石蜡包埋固定后作病理切片,然后染色镜检,光镜检查的染色法有:PAS染色,HE(苏木精-伊红)染色及抗酸染色等;荧光显微镜检查有吖啶橙(acridine orange)染色及CFW染色,组织学上所见:

(1)“菌丝苔被"是由大量中性粒细胞浸润,角膜基质层的凝固性坏死及胶原纤维肿胀所构成,很少见到完整的真菌.

(2)菌丝苔被病灶周围有大量菌丝,菌丝沿角膜板层平行蔓延,也可垂直穿通角膜小板向前向后生长,并穿过后弹力膜到达前房或后房引起炎症反应.

(3)“羽毛状边缘"是圆形细胞及浆细胞浸润,并非是真菌的菌丝.

6.共焦显微镜(confocal microscope)

共焦显微镜是20世纪90年代中期新兴的一种活体非创伤性的角膜疾病检查方法,可以从细胞水平观察角膜的不同层次结构,已应用于HSK和棘阿米巴角膜炎的诊断,Winchester(1997)应用共焦显微镜观察曲霉菌性角膜炎,角膜中可见高清晰度的菌丝直径6?m,长60～40?m,在时间,敏感性,安全性方面,共焦显微镜都明显优于以往任何一种诊断方法.