血红蛋白电泳

电泳法 HbA95%、HbA21.1%～3.2%、HbA32%～3%.Singer法HbF

(1)微量血红蛋白电电泳: ①浸膜:将醋酸纤维素膜漂浮于TEB缓冲液表面,待其均匀浸透沉下后,至少20min才可使用.这样可防止产生气泡. ②点样:取出醋酸纤维薄膜用滤纸吸去多余的水份.用微量吸管吸取血红蛋白溶液置于多标本加样器的凹型槽内,以多标本加样器蘸取血红蛋白液,点样于醋酸纤维素膜无光泽面.距阴极端1.5～2cm处,点样量约3～5μl同时平行地点上正常血红蛋白溶液作对照. ③电泳:在微型电泳槽两侧缓冲液槽内分别加入等量的BB缓冲液,以二层滤纸做盐桥搭在醋酸纤维薄膜支架上.将膜无光泽面向下,点样端接负极,平衡5min.接通电源.电压180V,电流量约为0.2mA/cm膜宽,电泳时间20～30min.槽中缓冲液可在倒换电极后再用1次. ④染色:电泳后的薄膜放在丽春红染色液中染色10min左右取出,用3%醋酸漂洗数次,至背景呈白色,阴干. ⑤透明:将醋酸纤维素膜置透明液中浸湿,贴于洁净玻璃板上,用玻棒赶去二者之间的气泡.于一层析缸内倒少量冰醋酸,将玻璃板反盖在层析缸上(有薄膜面向内).以挥发的冰醋酸熏10～20min,待膜透明即可取下. (2)醋酸纤维素膜电泳染色比色法: ①将TEB缓冲液浸泡过的4cm×6cm的醋酸纤维素膜取出,用滤纸吸干多余水分.于无光泽面距阴极端1.5cm处,用血红蛋白吸管直线状均匀整齐地滴加50g/L Hb溶液约5μl,待血红蛋白液渗入膜内后,将膜翻转置电泳槽支持板的滤纸桥上. ②电泳:电压180V,时间30～40min,以Hb各区带完全分离为准.电泳后交换电极,电泳缓冲液可多次使用. ③染色:将膜浸入染色液中,冬天需染2h,夏天或将染缸置25～30℃.可只染30min左右.注意如染色不透(如时间太短或血红蛋白溶液过浓),或电压过高使HbA带过于集中,易致色带剥脱,均影响定量的准确性.染毕用漂洗液洗数次,至背景漂净为止. ④定量:将漂净的膜取出,分别剪下各区带,及相当于HbA2大小的对照区带,各自放在相应的试管中.于HbA管中加浸出液10ml,其余各管加浸出液2ml,浸泡20min,时时振摇.使色带完全洗脱(注意在气温较高时,洗脱时间不可过长,否则洗脱液蓝色减退,并逐步变为紫红色).将洗脱液混匀,用721分光光度计,波长620nm,以空白调零,测各管吸光度. ⑤计算:同直接比色法. 试剂:同醋酸纤维素膜微量血红蛋白电电